Nrf2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421869-ACT

Il gene murino Nfe2l2 codifica il fattore di trascrizione Nrf2, un regolatore chiave dell’omeostasi redox cellulare e della difesa contro gli xenobiotici. In condizioni di stress ossidativo o elettrofilo, Nrf2 si accumula e promuove la trascrizione a partire dagli elementi di risposta antiossidante (ARE), inducendo geni coinvolti nel metabolismo del glutatione, nella rigenerazione di NADPH e negli enzimi di detossificazione di fase II. Questa via si integra con la proteostasi, la funzione mitocondriale e la segnalazione infiammatoria, plasmando le risposte cellulari ai tossici ambientali e allo stress metabolico. Un’attività di Nrf2 deregolata è stata associata a una suscettibilità alterata al danno ossidativo e all’infiammazione, rendendo Nfe2l2 un nodo ampiamente utilizzato per modellare i meccanismi di adattamento allo stress in sistemi rilevanti per la malattia.

Nrf2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nfe2l2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nrf2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nfe2l2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nfe2l2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nrf2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nfe2l2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nrf2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nrf2 nelle cellule tumorali con espressione di Nfe2l2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.