NPT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402216-ACT

SLC34A1 codifica la proteina umana di trasporto del fosfato sodio-dipendente NPT2 (NaPi-IIa), un importante trasportatore apicale nell’epitelio del tubulo prossimale renale che media il riassorbimento del fosfato inorganico accoppiato al gradiente di sodio. Controllando la gestione del fosfato, NPT2 contribuisce all’omeostasi sistemica del fosfato e interagisce con regolatori endocrini e reti di segnalazione che modellano il metabolismo minerale, incluse le vie legate a PTH e FGF23. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di SLC34A1 sono state associate a fenotipi di perdita renale di fosfato e a più ampie perturbazioni dell’equilibrio calcio–fosfato, rilevanti per nefrolitiasi, mineralizzazione ossea e disfunzione tubulare renale. Nei modelli cellulari e tissutali, SLC34A1 è utilizzato come indicatore di differenziazione del tubulo prossimale, traffico dei trasportatori e assorbimento di nutrienti dipendente dalla polarità epiteliale.

NPT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC34A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC34A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC34A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC34A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC34A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.