NPAT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404086-ACT

NPAT umano codifica una proteina nucleare che funge da regolatore della trascrizione strettamente accoppiato alla progressione del ciclo cellulare. NPAT è un componente chiave del programma di trascrizione dei geni degli istoni, coordinando l’espressione in fase S dei geni degli istoni dipendenti dalla replicazione e supportando l’assemblaggio della cromatina durante la replicazione del DNA. Attraverso la sua associazione con sottostrutture nucleari e la fosforilazione da parte di chinasi ciclina-dipendenti, NPAT integra segnali di checkpoint e di proliferazione che influenzano la stabilità del genoma. Un’attività di NPAT deregolata e un controllo alterato dei geni degli istoni sono stati collegati a fenotipi di proliferazione aberrante, rendendo NPAT rilevante per studi sul controllo oncogenico del ciclo cellulare e sui meccanismi di malattia guidati dalla cromatina.

NPAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPAT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPAT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPAT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPAT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPAT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPAT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPAT nelle cellule tumorali con espressione di NPAT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.