NPAT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404086-ACT

O NPAT humano codifica uma proteína nuclear que atua como regulador transcricional, estreitamente acoplado à progressão do ciclo celular. O NPAT é um componente-chave do programa de transcrição dos genes de histonas, coordenando a expressão dependente da fase S dos genes de histonas dependentes de replicação e sustentando a montagem da cromatina durante a replicação do DNA. Por meio de sua associação com subestruturas nucleares e de sua fosforilação por quinases dependentes de ciclina, o NPAT integra sinais de checkpoint e de proliferação que influenciam a estabilidade do genoma. A atividade desregulada do NPAT e o controle alterado dos genes de histonas têm sido associados a fenótipos de proliferação aberrante, tornando o NPAT relevante para estudos do controle oncogênico do ciclo celular e de mecanismos de doença impulsionados pela cromatina.

NPAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPAT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPAT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPAT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPAT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPAT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPAT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPAT em células tumorais com expressão de NPAT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.