NOXA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400498-ACT

PMAIP1 codifica NOXA, un membro pro-apoptotico “BH3-only” della famiglia BCL2 che promuove la permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale antagonizzando preferenzialmente MCL1 e altre proteine anti-apoptotiche correlate. NOXA viene indotta rapidamente da segnali di stress cellulare, incluse le risposte al danno del DNA dipendenti da p53, e integra l’apoptosi con la proteostasi e la segnalazione associata all’ipossia. Spostando l’equilibrio delle interazioni tra i membri della famiglia BCL2, NOXA influenza l’attivazione delle caspasi, l’integrità mitocondriale e le decisioni sul destino cellulare. Un’espressione deregolata di PMAIP1/NOXA è stata collegata a un’alterata predisposizione all’apoptosi nella biologia del cancro e a fenotipi di risposta allo stress rilevanti per la neurodegenerazione e per contesti infiammatori.

NOXA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PMAIP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NOXA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PMAIP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PMAIP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NOXA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PMAIP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NOXA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NOXA nelle cellule tumorali con espressione di PMAIP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.