NELF-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405667-ACT

Il gene umano **NELFB** codifica per **NELF-B**, una subunità centrale del complesso **Negative Elongation Factor (NELF)** che coopera con **DSIF** per imporre la pausa prossimale al promotore della **RNA polimerasi II** e modellare le fasi iniziali dell’allungamento trascrizionale. Regolando il rilascio dalla pausa e la cinetica della trascrizione, NELF-B influenza programmi genici responsivi agli stimoli, la comunicazione enhancer–promotore e, più in generale, il controllo dell’espressione genica legato alla cromatina. La pausa dipendente da NELF è strettamente connessa a vie che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress, rendendo la funzione di NELFB rilevante per studi meccanicistici sulla disregolazione trascrizionale. Un’alterata regolazione del controllo dell’allungamento è stata implicata in contesti patologici eterogenei, supportando l’uso di perturbazioni di NELFB per modellare come le dinamiche di pausa influenzino i fenotipi a valle.

NELF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NELFB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NELF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NELFB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NELFB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NELF-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NELFB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NELF-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NELF-B nelle cellule tumorali con espressione di NELFB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.