NDUFA6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405991-ACT

NDUFA6 codifica una piccola subunità accessoria del complesso I della catena respiratoria mitocondriale (NADH:ubichinone ossidoreduttasi) che supporta l’assemblaggio del complesso I e il trasferimento di elettroni nell’ambito della fosforilazione ossidativa. Contribuendo all’ossidazione del NADH e al mantenimento del gradiente protonico mitocondriale, NDUFA6 influenza la produzione di ATP, l’equilibrio redox e la segnalazione metabolica a valle. L’alterazione dei componenti del complesso I può favorire disfunzione mitocondriale, una gestione modificata delle specie reattive dell’ossigeno e cambiamenti compensatori nel metabolismo centrale del carbonio. In quanto fattore del complesso I codificato dal nucleo, NDUFA6 è rilevante per studi sulla bioenergetica mitocondriale e sui meccanismi alla base dei fenotipi di malattia mitocondriale associati al complesso I.

NDUFA6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDUFA6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDUFA6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDUFA6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDUFA6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDUFA6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDUFA6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDUFA6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDUFA6 nelle cellule tumorali con espressione di NDUFA6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.