Ndfip2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405125-ACT

NDFIP2 (Ndfip2) codifica un adattatore di membrana endosomiale che si lega e attiva le ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT della famiglia NEDD4, contribuendo a instradare il carico ubiquitinato attraverso l’endocitosi e la degradazione associata ai lisosomi. Tramite queste interazioni, Ndfip2 contribuisce alla regolazione dipendente dall’ubiquitina dell’abbondanza delle proteine di membrana, del traffico vescicolare e degli output di segnalazione collegati alle risposte cellulari allo stress. L’espressione di NDFIP2 è stata studiata in contesti immunitari ed epiteliali, in cui il controllo mediato dall’ubiquitina delle dinamiche di recettori e trasportatori può influenzare programmi di infiammazione, sopravvivenza e differenziamento. La disregolazione del traffico endolisosomiale e delle reti di ligasi dell’ubiquitina è ampiamente rilevante per la biologia del cancro e per i meccanismi neuroimmuni, a supporto di NDFIP2 come nodo utile per studi mirati alle vie di segnalazione.

Ndfip2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDFIP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ndfip2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDFIP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDFIP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ndfip2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDFIP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ndfip2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ndfip2 nelle cellule tumorali con espressione di NDFIP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.