NBC4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412900-ACT

Il gene umano **SLC4A5** codifica il cotrasportatore elettro-neutro sodio/bicarbonato **NBC4**, un trasportatore di membrana che media un flusso di HCO₃⁻ accoppiato al Na⁺ per sostenere la regolazione del pH intracellulare, l’omeostasi del bicarbonato e il trasporto ionico epiteliale. Modificando la capacità tampone del citosol e il movimento transepiteliale del bicarbonato, NBC4 contribuisce a processi quali la gestione renale e intestinale degli elettroliti e le risposte cellulari allo stress acido–base. Alterazioni dell’attività di SLC4A5 sono state studiate nel contesto di un trasporto ionico disregolato e di una segnalazione dipendente dal pH che può influenzare l’eccitabilità, il metabolismo e l’omeostasi tissutale. Queste caratteristiche rendono SLC4A5 un bersaglio utile per studiare la biologia dei trasportatori SLC, l’energetica del trasporto di membrana e le vie regolatorie collegate al pH.

NBC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC4A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NBC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC4A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC4A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NBC4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC4A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NBC4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NBC4 nelle cellule tumorali con espressione di SLC4A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.