N-type Ca CP α1B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402397-ACT

CACNA1B codifica la subunità α1B, formante il poro, dei canali del calcio di tipo N voltaggio-dipendenti (CaV2.2), che mediano l’ingresso di Ca2+ indotto dalla depolarizzazione nelle cellule eccitabili. L’apertura del canale mette in relazione l’attività di membrana con la segnalazione intracellulare del calcio, coordinando l’attracco delle vescicole presinaptiche e il rilascio di neurotrasmettitori attraverso vie Ca2+-dipendenti e chinasi a valle. L’attività di CACNA1B modella la trasmissione sinaptica, l’eccitabilità neuronale e la secrezione neuroendocrina; variazioni funzionali sono associate ad alterazioni dell’elaborazione del dolore e a fenotipi neuropsichiatrici. In quanto componente centrale delle reti di segnalazione dipendenti dal calcio, CaV2.2 viene studiato di routine in modelli di fisiologia sinaptica e di regolazione dei canali ionici.

N-type Ca CP α1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CACNA1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

N-type Ca CP α1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CACNA1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CACNA1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di N-type Ca CP α1B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CACNA1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da N-type Ca CP α1B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via N-type Ca CP α1B nelle cellule tumorali con espressione di CACNA1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.