N-type Ca CP α1B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402397-ACT

CACNA1B codifica a subunidade α1B formadora do poro dos canais de cálcio do tipo N dependentes de voltagem (CaV2.2), que mediam o influxo de Ca2+ evocado pela despolarização em células excitáveis. A abertura do canal acopla a atividade da membrana à sinalização intracelular por cálcio, coordenando o acoplamento (docking) de vesículas pré-sinápticas e a liberação de neurotransmissores por vias dependentes de Ca2+ e quinases a jusante. A atividade de CACNA1B molda a transmissão sináptica, a excitabilidade neuronal e a secreção neuroendócrina, com variação funcional associada a alterações no processamento da dor e a fenótipos neuropsiquiátricos. Como componente central de redes de sinalização dependentes de cálcio, o CaV2.2 é rotineiramente estudado em modelos de fisiologia sináptica e regulação de canais iónicos.

N-type Ca CP α1B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CACNA1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

N-type Ca CP α1B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CACNA1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CACNA1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de N-type Ca CP α1B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CACNA1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de N-type Ca CP α1B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via N-type Ca CP α1B em células tumorais com expressão de CACNA1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.