MYL9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401577-ACT

MYL9 codifica la catena leggera della miosina 9, una catena leggera regolatoria che modula l’attività motoria della miosina II non muscolare attraverso un controllo, dipendente dalla fosforilazione, della contrattilità actomiosinica. Agisce a valle delle vie di segnalazione RHOA/ROCK e Ca2+/calmodulina–MLCK, influenzando la formazione delle fibre di stress, la dinamica delle adesioni focali, la citocinesi e la tensione delle giunzioni cellula–cellula. Plasmando la meccanica del citoscheletro, MYL9 contribuisce alla migrazione cellulare e a programmi contrattili di tipo muscolo liscio vascolare in contesti stromali ed endoteliali. Una contrattilità associata a MYL9 deregolata è stata collegata a processi di rimodellamento patologico rilevanti per la fibrosi, la disfunzione vascolare e le alterazioni del microambiente tumorale.

MYL9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYL9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MYL9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYL9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYL9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MYL9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYL9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MYL9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MYL9 nelle cellule tumorali con espressione di MYL9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.