MSH2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400966-ACT

MSH2 codifica un componente centrale del sistema di riparazione degli errori di appaiamento del DNA (MMR), che preserva l’integrità del genoma riconoscendo appaiamenti errati tra basi e anse di inserzione–delezione che si formano durante la replicazione e la ricombinazione del DNA. Nell’uomo, MSH2 forma eterodimeri con MSH6 (MutSα) o con MSH3 (MutSβ) per avviare il riconoscimento della lesione e coordinare la riparazione a valle con MLH1/PMS2, collegando l’MMR alla fedeltà della replicazione, alla segnalazione del danno al DNA e alle risposte dei checkpoint del ciclo cellulare. L’alterazione o la deregolazione di MSH2 compromette la capacità di riparazione, aumenta il carico mutazionale e contribuisce all’instabilità dei microsatelliti, un fenotipo distintivo in molteplici contesti tumorali. Di conseguenza, MSH2 è ampiamente studiato nei pathway che governano il mantenimento del genoma, la mutagenesi e le risposte cellulari allo stress genotossico.

MSH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MSH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MSH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MSH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MSH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MSH2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MSH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MSH2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MSH2 nelle cellule tumorali con espressione di MSH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.