Mfn1/Mitofusin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400637-ACT

MFN1 umano codifica la Mitofusina 1 (Mfn1), una GTPasi di tipo dinammina incorporata nella membrana mitocondriale esterna che media la fusione dei mitocondri e modella l’architettura della rete mitocondriale. Mfn1 coopera con MFN2 e OPA1 per regolare l’organizzazione delle creste, il mantenimento del DNA mitocondriale e l’efficienza bioenergetica, collegando l’equilibrio fusione–fissione alla mitofagia e alla segnalazione dell’apoptosi. Controllando la connettività e la distribuzione degli organelli, MFN1 influenza il metabolismo cellulare e le risposte allo stress in vie legate alla fosforilazione ossidativa e all’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno. La disregolazione della dinamica mitocondriale che coinvolge MFN1 è stata associata a neurodegenerazione, disfunzione dei cardiomiociti e fenotipi metabolici, a conferma della sua rilevanza negli studi sul controllo di qualità mitocondriale e sui meccanismi di malattia.

Mfn1/Mitofusin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MFN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mfn1/Mitofusin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MFN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MFN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mfn1/Mitofusin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MFN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mfn1/Mitofusin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mfn1/Mitofusin 1 nelle cellule tumorali con espressione di MFN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.