MATH-5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415110-ACT

ATOH7 codifica il fattore di trascrizione basic helix–loop–helix MATH-5, un regolatore chiave della neurogenesi retinica che promuove la competenza e la differenziazione delle cellule gangliari della retina, influenzando al contempo decisioni più ampie sul destino delle linee neuronali. MATH-5 si integra con reti trascrizionali dello sviluppo che coinvolgono la segnalazione Notch, fattori bHLH neurogenici e programmi a valle di guida assonale e di uscita dal ciclo cellulare, per coordinare la tempistica della specificazione neuronale. Un’espressione o una funzione deregolata di ATOH7 è collegata ad alterazioni dello sviluppo retinico ed è stata associata ad anomalie congenite del nervo ottico e della retina, nonché a una maggiore suscettibilità a disturbi neuroevolutivi della visione. In quanto nodo nella precoce definizione del campo oculare e nella determinazione del destino neuronale, ATOH7 è ampiamente utilizzato per studiare i circuiti di regolazione genica che governano la formazione dei neuroni sensoriali.

MATH-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATOH7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MATH-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATOH7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATOH7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MATH-5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATOH7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MATH-5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MATH-5 nelle cellule tumorali con espressione di ATOH7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.