LNX3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403866-ACT

PDZRN3 codifica LNX3, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING e con domini multipli PDZ, che coordina le interazioni proteina-proteina e il turnover ubiquitina-dipendente di componenti della segnalazione. Attraverso l’assemblaggio di complessi mediato da scaffold e l’ubiquitinazione, LNX3 è implicata nella regolazione del traffico dei recettori e dei programmi trascrizionali a valle che modellano la polarità cellulare, la differenziazione e il rimodellamento tissutale. Le connessioni riportate con vie che governano la segnalazione dei fattori di crescita e la via Wnt/polarità cellulare planare evidenziano ruoli nella patterning dello sviluppo e nell’organizzazione del citoscheletro. Un’espressione deregolata di PDZRN3/LNX3 è stata associata a stati proliferativi e di differenziazione alterati in molteplici contesti rilevanti per la malattia, supportandone l’uso come nodo meccanicistico in studi focalizzati sulle vie di segnalazione.

LNX3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDZRN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LNX3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDZRN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDZRN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LNX3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDZRN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LNX3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LNX3 nelle cellule tumorali con espressione di PDZRN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.