KIR3.2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405031-ACT

KCNJ6 codifica per la subunità del canale del potassio umano a rettificazione entrante KIR3.2 (GIRK2), un effettore chiave della segnalazione mediata da recettori accoppiati a proteine G, che contribuisce a stabilizzare il potenziale di membrana a riposo e a ridurre l’eccitabilità cellulare. In seguito all’attivazione, la subunità Gβγ rilasciata dai recettori accoppiati a Gi/o promuove l’apertura del canale, collegando gli input di neurotrasmettitori e neuromodulatori alla conduttanza al potassio nei neuroni e in altre cellule eccitabili. KIR3.2 contribuisce alla regolazione della scarica dei potenziali d’azione, dell’integrazione sinaptica e delle oscillazioni di rete, inserendosi in vie che modellano le risposte neurofisiologiche. Un’attività o un’espressione deregolata di KCNJ6 è stata associata ad alterazioni della segnalazione neuronale ed è stata studiata in contesti quali fenotipi del neurosviluppo e neuropsichiatrici, oltre alla suscettibilità alle crisi convulsive.

KIR3.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR3.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR3.2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR3.2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR3.2 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.