KCNT1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432714-ACT

Kcnt1 codifica il canale del potassio KCNT1 del topo attivato dal sodio, un canale K+ ad alta conduttanza che accoppia gli aumenti intracellulari di Na+ alla ripolarizzazione di membrana e all’adattamento della frequenza di scarica nei neuroni. Modulando l’iperpolarizzazione post-potenziale d’azione e la dinamica dei burst, KCNT1 influenza l’integrazione sinaptica e l’eccitabilità delle reti neuronali, intersecandosi con vie che regolano l’omeostasi ionica e la segnalazione dipendente dall’attività. Alterazioni dell’attività di KCNT1 sono associate a fenotipi di ipereccitabilità neuronale e sono state studiate nel contesto dei meccanismi legati a crisi epilettiche e disturbi del neurosviluppo, a supporto della sua rilevanza nella disfunzione a livello di circuito. Nei modelli murini, Kcnt1 rappresenta un nodo sperimentale maneggevole per indagare come le conduttanze KNa modulino l’equilibrio eccitatorio–inibitorio e la plasticità.

KCNT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Kcnt1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCNT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Kcnt1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Kcnt1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCNT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Kcnt1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCNT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCNT1 nelle cellule tumorali con espressione di Kcnt1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.