IP3R-III Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-421194-LAC

Itpr3 codifica il recettore dell’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 3 (IP3R-III), un canale di rilascio di Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico attivato a valle della segnalazione dei GPCR e delle chinasi tirosiniche recettoriali tramite l’IP3 generato dalla PLC. I transitori di Ca²⁺ mediati da IP3R-III regolano processi che includono la secrezione, il trasporto epiteliale, la bioenergetica mitocondriale e l’espressione genica Ca²⁺-dipendente attraverso vie quali calcineurina–NFAT e la segnalazione CaMK. Nei tessuti murini, l’espressione di IP3R-III è arricchita nelle linee cellulari epiteliali e secretorie, a supporto di studi sulla segnalazione del Ca²⁺ polarizzata, sui siti di contatto RE–mitocondri e sulle oscillazioni di calcio accoppiate allo stimolo. Un’attività deregolata di IP3R-III e l’omeostasi del Ca²⁺ alterata sono state collegate a risposte di stress cellulare e a fenotipi rilevanti per la malattia che coinvolgono disfunzione epiteliale e segnalazione proliferativa aberrante, rendendo Itpr3 un nodo utile per la modellizzazione meccanicistica.

Le particelle di attivazione lentivirale IP3R-III (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Itpr3 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale IP3R-III (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Itpr3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di IP3R-III. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Itpr3 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.