INTS3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408952-ACT

La subunità 3 del complesso Integrator (INTS3) è un componente fondamentale del complesso Integrator, un assemblaggio multiproteico che accoppia la trascrizione mediata dall’RNA polimerasi II con il processamento dell’estremità 3′ degli RNA nucleari piccoli e, più in generale, con la regolazione dell’output trascrizionale. INTS3 partecipa inoltre ai programmi di mantenimento del genoma attraverso interazioni coinvolte nel riconoscimento e nella riparazione del danno al DNA, supportando le risposte allo stress replicativo e la preservazione dell’integrità cromosomica. Modulando il processamento dell’RNA e l’omeostasi trascrizionale, INTS3 influenza la progressione del ciclo cellulare e le reti di espressione genica adattative allo stress. La deregolazione delle vie associate a Integrator e del coordinamento della riparazione del DNA è implicata in fenotipi di proliferazione alterata e instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi del metabolismo nucleare dell’RNA.

INTS3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INTS3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

INTS3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INTS3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INTS3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di INTS3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INTS3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da INTS3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via INTS3 nelle cellule tumorali con espressione di INTS3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.