HYPB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402789-ACT

SETD2 (HYPB) codifica una metiltransferasi degli istoni contenente un dominio SET che catalizza la trimetilazione della lisina 36 dell’istone H3 (H3K36me3) lungo i corpi genici attivamente trascritti. Questo marcatore della cromatina coordina l’allungamento trascrizionale con lo splicing del pre‑mRNA, la riparazione dei danni al DNA e il mantenimento della stabilità genomica tramite il reclutamento di complessi “reader” di H3K36me3. L’attività di SETD2 influenza anche i meccanismi di riparazione dei mismatch del DNA e le vie di ricombinazione omologa, collegando la regolazione epigenetica alla fedeltà della replicazione. L’alterazione o la disregolazione della metilazione di H3K36 dipendente da SETD2 è associata a stati della cromatina anomali, disregolazione della trascrizione e instabilità genomica osservate in molteplici contesti di tumori e malattie dello sviluppo.

HYPB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SETD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HYPB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SETD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SETD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HYPB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SETD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HYPB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HYPB nelle cellule tumorali con espressione di SETD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.