HRF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402606-ACT

Il TPT1 umano codifica l’histamine releasing factor (HRF), una proteina multifunzionale conservata implicata nella crescita cellulare, nella sopravvivenza e nell’adattamento allo stress. HRF partecipa a processi legati al controllo della traduzione, alla dinamica dei microtubuli e alla regolazione dell’apoptosi, e può influenzare la segnalazione immunitaria e le risposte infiammatorie attraverso vie associate all’istamina. Un’espressione deregolata di TPT1/HRF è stata riportata in molteplici contesti patologici, inclusi la biologia del cancro, l’infiammazione allergica e altre condizioni immuno-mediate, in cui può modulare la proliferazione, le reti citochiniche e la resilienza cellulare. Queste caratteristiche rendono TPT1 un bersaglio utile per analizzare i percorsi che collegano la proteostasi e le risposte allo stress a fenotipi immunitari e associati ai tumori.

HRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HRF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HRF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HRF nelle cellule tumorali con espressione di TPT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.