HRC Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420947-ACT

Mouse Hrc codifica la proteina legante il calcio ricca in istidina (HRC), una componente luminale del reticolo sarcoplasmatico che modula l’immagazzinamento e il rilascio di Ca²⁺ influenzando l’attività del recettore della rianodina e il riassorbimento dipendente da SERCA. Modellando l’accoppiamento eccitazione–contrazione e l’omeostasi del calcio intracellulare, HRC contribuisce alla funzione dei cardiomiociti e del muscolo scheletrico, dove un ciclo del Ca²⁺ finemente regolato governa la contrattilità e le risposte allo stress. Una deregolazione dell’espressione di Hrc o un’alterazione della gestione del Ca²⁺ è comunemente studiata nel contesto del rimodellamento cardiaco, dei meccanismi aritmogenici e dei fenotipi associati alle miopatie. In quanto regolatore nodale della dinamica del calcio nel RS, HRC è rilevante per le vie che controllano la segnalazione del calcio, la proteostasi e l’adattamento muscolare a stimoli fisiologici e patologici.

HRC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hrc senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HRC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hrc nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hrc, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HRC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hrc nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HRC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HRC nelle cellule tumorali con espressione di Hrc silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.