HPRT Plasmide Double Nickase (m2): sc-420943-NIC-2

L’Hprt murino codifica l’ipoxantina‑guanina fosforibosiltransferasi (HPRT), un enzima chiave della via di recupero (salvage) delle purine che catalizza la conversione di ipoxantina e guanina in IMP e GMP utilizzando il PRPP, contribuendo così all’omeostasi dei nucleotidi e limitando la necessità di sintesi de novo delle purine. L’attività di HPRT influenza la proliferazione cellulare e le risposte allo stress metabolico attraverso la regolazione dei pool di purine, ed è comunemente sfruttata nella selezione in HAT e nei saggi di resistenza alla 6‑tioguanina per analizzare la funzionalità della via di recupero e la mutagenesi. Un’alterazione della funzione di HPRT è associata a una deregolazione del metabolismo delle purine ed è ampiamente utilizzata come locus di riferimento per studiare le risposte al danno del DNA, gli esiti del genome editing e i contributi metabolici a fenotipi neurocomportamentali ed ematopoietici nei modelli murini. In quanto gene housekeeping legato al cromosoma X, Hprt funge inoltre da solido riferimento per la normalizzazione dell’espressione e da marcatore di selezione/contro-selezione nei flussi di lavoro di ingegneria cellulare nei mammiferi.

HPRT Il plasmide Double Nickase (m2) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus Hprt nelle linee cellulari mouse. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di Hprt. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di Hprt. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con Hprt interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.