HECTD1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431500-ACT

Il gene murino Hectd1 codifica HECTD1, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT che catalizza il trasferimento di ubiquitina su substrati proteici per controllarne stabilità, localizzazione e output di segnalazione. HECTD1 è stata collegata alla regolazione della proteostasi, dell’organizzazione del citoscheletro e della migrazione cellulare tramite il rimodellamento, dipendente dall’ubiquitina, di complessi proteici, influenzando vie di sviluppo e di risposta allo stress. Nei modelli murini, alterazioni della funzione di Hectd1 sono state associate al patterning embrionale e allo sviluppo del tubo neurale, evidenziandone la rilevanza per i meccanismi alla base delle malformazioni congenite. In quanto componente della via dell’ubiquitina, HECTD1 è studiata anche in contesti in cui un’ubiquitinazione deregolata contribuisce a una segnalazione aberrante e all’omeostasi tissutale.

HECTD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hectd1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HECTD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hectd1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hectd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HECTD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hectd1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HECTD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HECTD1 nelle cellule tumorali con espressione di Hectd1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.