HDMCP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415327-ACT

Il gene umano SLC25A47 codifica per HDMCP, un trasportatore della membrana interna mitocondriale appartenente alla famiglia dei solute carrier, implicato nel controllo dello scambio di metaboliti mitocondriali e dell’efficienza respiratoria. L’attività di HDMCP è collegata alla regolazione della fosforilazione ossidativa, del potenziale di membrana mitocondriale e di programmi più ampi di omeostasi energetica che coordinano l’utilizzo dei nutrienti nei tessuti metabolicamente attivi. Un’espressione alterata dei trasportatori mitocondriali, incluso HDMCP, è stata associata a una disregolazione del metabolismo di lipidi e glucosio, a stress ossidativo e a cambiamenti di segnalazione che influenzano l’adattamento cellulare alla richiesta energetica. Di conseguenza, SLC25A47 è di interesse per lo studio della bioenergetica mitocondriale, del rimodellamento delle vie metaboliche e dei meccanismi che collegano la funzione mitocondriale a fenotipi rilevanti per la malattia.

HDMCP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC25A47 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HDMCP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC25A47 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC25A47, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HDMCP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC25A47 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HDMCP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HDMCP nelle cellule tumorali con espressione di SLC25A47 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.