HDMCP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415327-ACT

Das humane Gen SLC25A47 kodiert den Transporter der inneren Mitochondrienmembran HDMCP, ein Mitglied der Solute-Carrier-Familie, das an der Kontrolle des mitochondrialen Metabolitenaustauschs und der respiratorischen Effizienz beteiligt ist. Die HDMCP-Aktivität steht mit der Regulation der oxidativen Phosphorylierung, des mitochondrialen Membranpotenzials und übergeordneter Programme der Energiehomöostase in Zusammenhang, die die Nährstoffnutzung in metabolisch aktiven Geweben koordinieren. Eine veränderte Expression mitochondrialer Carrier, einschließlich HDMCP, wurde mit einer dysregulierten Lipid- und Glukosemetabolisierung, oxidativem Stress sowie Signalwegveränderungen in Verbindung gebracht, die die zelluläre Anpassung an den Energiebedarf beeinflussen. Daher ist SLC25A47 für die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik, der Umgestaltung metabolischer Stoffwechselwege und der Mechanismen von Interesse, die die mitochondriale Funktion mit krankheitsrelevanten Phänotypen verknüpfen.

HDMCP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC25A47-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HDMCP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC25A47-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC25A47-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HDMCP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC25A47-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HDMCP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HDMCP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC25A47-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.