HAX-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423888-ACT

Il gene murino Hax1 codifica HAX-1, una proteina associata prevalentemente ai mitocondri e al reticolo endoplasmatico che regola la sopravvivenza cellulare modulando l’apoptosi, l’omeostasi del calcio e le risposte allo stress. HAX-1 è stata collegata al controllo dell’integrità della membrana mitocondriale e all’integrazione di vie di segnalazione che influenzano la funzione dei leucociti e, più in generale, l’omeostasi immunitaria. Attraverso interazioni con componenti del citoscheletro e con il macchinario del traffico vescicolare, HAX-1 può inoltre influenzare la migrazione cellulare e il trasporto intracellulare. La disregolazione dei programmi di sopravvivenza dipendenti da HAX-1 è rilevante in modelli di disfunzione ematopoietica e infiammazione, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di adattamento allo stress.

HAX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hax1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HAX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hax1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hax1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HAX-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hax1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HAX-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HAX-1 nelle cellule tumorali con espressione di Hax1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.