GPR88 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403566-ACT

GPR88 codifica un recettore orfano accoppiato a proteine G (GPCR) altamente arricchito nei neuroni spinosi medi dello striato e contribuisce a modulare l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica. Tramite l’accoppiamento a proteine G eterotrimeriche, GPR88 è coinvolto nella modulazione della segnalazione dipendente da cAMP, di cascate di chinasi a valle e di programmi trascrizionali dipendenti dall’attività che plasmano la funzione dei circuiti corticostriatali. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di GPR88 sono state associate a fenotipi neuropsichiatrici e neurosviluppo, inclusi cambiamenti nel controllo motorio, nei comportamenti legati alla ricompensa e nei processi cognitivi. Queste caratteristiche rendono GPR88 un bersaglio utile per analizzare le vie regolative mediate dai GPCR in modelli neuronali umani e per studiare le risposte delle reti geniche nelle cellule della linea striatale.

GPR88 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR88 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR88 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR88 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR88, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR88. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR88 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR88 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR88 nelle cellule tumorali con espressione di GPR88 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.