GPR54 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-403766-LAC

KISS1R (GPR54) è un GPCR di classe A che lega le kisspeptine per regolare la segnalazione dell’asse riproduttivo e l’inizio della pubertà attraverso il controllo dell’attività dei neuroni che rilasciano l’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). In seguito al legame con il ligando, GPR54 si accoppia prevalentemente a Gαq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare il Ca2+ intracellulare e stimolare una segnalazione dipendente da PKC, con effetti a valle sui programmi trascrizionali MAPK/ERK. Questa via integra il controllo neuroendocrino con processi cellulari più ampi, tra cui secrezione ormonale, eccitabilità neuronale ed espressione genica. La disregolazione o le variazioni genetiche di KISS1R sono state associate a disturbi della tempistica puberale e all’ipogonadismo ipogonadotropo, e la segnalazione alterata è stata studiata nella biologia dei tumori a componente endocrina e in vie associate alla metastatizzazione.

Le particelle di attivazione lentivirale GPR54 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di KISS1R in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale GPR54 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione KISS1R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di GPR54. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo KISS1R e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.