GPR54 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403766-ACT

KISS1R (GPR54) è un GPCR di classe A che lega le kisspeptine codificate da KISS1 per regolare il controllo neuroendocrino dell’inizio della pubertà e la funzione dell’asse riproduttivo. In seguito al legame del ligando, GPR54 si accoppia principalmente a Gαq/11, stimolando la segnalazione della fosfolipasi C, la mobilizzazione del calcio dipendente da IP3 e le vie a valle MAPK/ERK e PKC, che influenzano l’espressione genica e l’eccitabilità cellulare. Questo nodo di segnalazione è centrale per l’attivazione dei neuroni ipotalamici del GnRH e integra input di sviluppo, metabolici e ambientali che modulano il rilascio delle gonadotropine. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di KISS1R sono state collegate a disturbi della tempistica puberale e all’ipogonadismo ipogonadotropo; le perturbazioni della via di GPR54 sono inoltre studiate anche nel contesto della biologia dei tumori ormono-dipendenti e dei programmi di migrazione cellulare.

GPR54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KISS1R senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KISS1R nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KISS1R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR54. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KISS1R nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR54 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR54 nelle cellule tumorali con espressione di KISS1R silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.