GPR41 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402190-ACT

FFAR3 codifica il recettore accoppiato a proteine G GPR41, un sensore di superficie cellulare per gli acidi grassi a catena corta come propionato e butirrato, derivati dalla fermentazione microbica. Dopo il legame con il ligando, GPR41 si accoppia principalmente alla segnalazione Gi/o, riducendo i livelli di cAMP e modulando vie a valle che influenzano il metabolismo cellulare, l’omeostasi energetica e il tono infiammatorio. L’attività di FFAR3/GPR41 è stata collegata alla regolazione della secrezione ormonale e alla comunicazione neuro‑immunitaria, collocandola all’intersezione tra segnalazione intestino–microbioma e fisiologia dell’ospite. Una segnalazione di FFAR3 deregolata è quindi di interesse negli studi sulla disfunzione metabolica e sui meccanismi delle malattie infiammatorie, in cui risulta alterato il sensing dei nutrienti mediato da GPCR.

GPR41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FFAR3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FFAR3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FFAR3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR41. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FFAR3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR41 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR41 nelle cellule tumorali con espressione di FFAR3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.