GlyT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403077-ACT

Il gene umano SLC6A5 codifica il trasportatore della glicina 2 (GlyT2), un trasportatore presinaptico Na⁺/Cl⁻-dipendente che media la ricaptazione della glicina ad alta affinità nei neuroni glicinergici inibitori. Mantenendo l’approvvigionamento vescicolare di glicina e modulando la disponibilità sinaptica di glicina, GlyT2 è fondamentale per il riciclo del neurotrasmettitore, per i circuiti inibitori del midollo spinale e del tronco encefalico e per la regolazione complessiva dell’elaborazione motoria e sensoriale. La funzione di SLC6A5 si integra con i processi di trasporto dei soluti, trasporto di membrana accoppiato agli ioni e trasmissione sinaptica, che influenzano l’eccitabilità neuronale. Un’alterazione dell’attività o dell’espressione di GlyT2 è associata a una trasmissione inibitoria deregolata ed è rilevante per la ricerca su fenotipi ereditari di risposta di sobbalzo (startle) e altri disturbi del controllo motorio.

GlyT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC6A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GlyT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC6A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC6A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GlyT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC6A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GlyT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GlyT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC6A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.