GLT25D2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405276-ACT

COLGALT2 codifica GLT25D2, una beta(1-O)galattosiltransferasi del collagene (GLT25D2) che avvia la glicosilazione dei residui di idrossilisina nel collagene aggiungendo galattosio, un passaggio necessario per la successiva glucosilazione e per la corretta maturazione della matrice extracellulare. Questa modifica post-traduzionale influenza il ripiegamento del collagene, la secrezione, la fibrillogenesi e l’organizzazione della matrice, collegando l’attività di GLT25D2 alla proteostasi nella via secretoria e al rimodellamento della matrice specifico per tessuto. Un’alterata glicosilazione del collagene è rilevante negli studi su fibrosi, integrità del tessuto connettivo, dinamiche stromali associate ai tumori e biologia muscoloscheletrica, in cui la composizione della matrice extracellulare modula segnalazione e proprietà meccaniche. GLT25D2 rappresenta quindi un nodo utile per indagare come la processazione del collagene influenzi le interazioni cellula–matrice, l’adesione e le vie a valle sensibili all’architettura della matrice.

GLT25D2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COLGALT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLT25D2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COLGALT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COLGALT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLT25D2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COLGALT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLT25D2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLT25D2 nelle cellule tumorali con espressione di COLGALT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.