GI24 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407831-ACT

VSIR codifica il recettore immunoregolatorio GI24 (noto anche come VISTA), una molecola checkpoint della famiglia B7 espressa prevalentemente nei compartimenti ematopoietico e mieloide, che modula l’attivazione delle cellule T e la tolleranza periferica. GI24 partecipa alla segnalazione della sinapsi immunologica e a vie soppressive che modellano la produzione di citochine, la funzione delle cellule presentanti l’antigene e i livelli basali di infiammazione nei microambienti tissutali. Una deregolazione dell’espressione di VSIR è stata associata ad alterazioni dei fenotipi di evasione immunitaria e dei pattern di infiltrazione immune nel cancro, nonché a risposte infiammatorie anomale in contesti di malattie autoimmuni e infettive. Di conseguenza, VSIR è spesso studiato in relazione a vie che regolano l’esaurimento delle cellule T, l’immunosoppressione mediata dai mieloidi e il crosstalk tra tumore e sistema immunitario.

GI24 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VSIR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GI24 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VSIR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VSIR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GI24. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VSIR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GI24 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GI24 nelle cellule tumorali con espressione di VSIR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.