Ganglioside sialidase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404848-ACT

NEU3 codifica una sialidasi dei gangliosidi umana associata alla membrana plasmatica, che rimuove gli acidi sialici terminali dai gangliosidi e da glicoesfingolipidi correlati, rimodellando la composizione dei glicani sulla superficie cellulare. Modulando microdomini di membrana dipendenti dai gangliosidi, NEU3 può influenzare la segnalazione dei recettori tirosin-chinasici, l’adesione e la migrazione cellulare, e le vie a valle collegate a MAPK/PI3K che rispondono ai cambiamenti nell’organizzazione lipide–proteina. Un’attività sialidasica alterata incide sul metabolismo dei glicoesfingolipidi e sulle reti di segnalazione infiammatoria, rendendo NEU3 un nodo utile per studiare come il rimodellamento dei glicani regoli la comunicazione cellulare. Un’espressione deregolata di NEU3 è stata riportata in contesti di crescita aberrante e rimodellamento tissutale, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici sulla segnalazione associata a patologie e sulla biologia di membrana.

Ganglioside sialidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEU3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ganglioside sialidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEU3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEU3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ganglioside sialidase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEU3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ganglioside sialidase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ganglioside sialidase nelle cellule tumorali con espressione di NEU3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.