GALR1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404381-ACT

GALR1 codifica il recettore umano della galanina 1, un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) di tipo rodopsina che lega il neuropeptide galanina e trasduce segnali principalmente tramite Gi/o per inibire l’adenilato ciclasi e modulare a valle l’attività cAMP/PKA. L’attivazione del recettore influenza l’eccitabilità neuronale, la trasmissione sinaptica e la secrezione neuroendocrina, con ulteriori effetti sulla segnalazione MAPK e sulla dinamica del calcio intracellulare a seconda del contesto cellulare. GALR1 contribuisce alla regolazione dell’appetito, della nocicezione, dei comportamenti correlati all’umore e della funzione autonomica, e alterazioni della segnalazione galanina–GALR1 sono state implicate in fenotipi neurologici e psichiatrici. In biologia del cancro, sono state riportate un’espressione differenziale di GALR1 e una riorganizzazione delle vie di segnalazione dei GPCR in diversi contesti tumorali, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico per studi di segnalazione e trascrizionali.

GALR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GALR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GALR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GALR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GALR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GALR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GALR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GALR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GALR1 nelle cellule tumorali con espressione di GALR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.