frizzled-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401365-ACT

FZD1 codifica frizzled-1, un recettore WNT a sette eliche transmembrana che collega i ligandi WNT extracellulari a cascate di segnalazione intracellulari che controllano la specificazione del destino cellulare, la polarità e la proliferazione. In seguito al legame del ligando, frizzled-1 può attivare programmi trascrizionali canonici dipendenti da β-catenina/TCF e interagire con le vie non canoniche della polarità cellulare planare e WNT/Ca²⁺, influenzando la dinamica del citoscheletro e la migrazione. Una segnalazione di FZD1 deregolata è stata associata all’attività anomala della rete WNT osservata nella trasformazione oncogena, nella fibrosi e nei disturbi dello sviluppo. In quanto recettore di superficie cellulare, frizzled-1 è utile anche per studiare la selettività ligando–recettore, il cross-talk tra vie di segnalazione e il trafficking del recettore in sistemi modello umani.

frizzled-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FZD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

frizzled-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FZD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FZD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di frizzled-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FZD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da frizzled-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via frizzled-1 nelle cellule tumorali con espressione di FZD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.