FMO3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406605-ACT

L’FMO3 (flavin-containing monooxygenase 3) umano è una monoossigenasi dipendente da FAD localizzata nel reticolo endoplasmatico, che catalizza reazioni di N‑ossigenazione e S‑ossigenazione su ammine xenobiotiche ed endogene, contribuendo alla clearance metabolica di fase I. Svolge un ruolo centrale nel metabolismo ossidativo epatico e si integra con reti più ampie di detossificazione che coordinano l’attività con gli enzimi CYP, le vie di coniugazione e l’omeostasi redox cellulare. Alterazioni nell’espressione o nell’attività di FMO3 possono modificare i profili dei metaboliti, inclusa la conversione della trimetilammina (TMA) in N‑ossido di trimetilammina (TMAO), con effetti a valle sulla segnalazione metabolica e infiammatoria. La variabilità genetica di FMO3 è associata alla trimetilaminuria ed è spesso sfruttata in studi sulle differenze interindividuali nel metabolismo dei farmaci e nella sensibilità alle sostanze chimiche.

FMO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FMO3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FMO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FMO3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FMO3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FMO3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FMO3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FMO3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FMO3 nelle cellule tumorali con espressione di FMO3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.