Filaggrin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406347-ACT

FLG2 codifica la filaggrina 2, una proteina della differenziazione epidermica che contribuisce all’organizzazione dei filamenti intermedi di cheratina e alla maturazione dell’involucro corneo nelle fasi tardive durante la differenziazione terminale dei cheratinociti. La filaggrina 2 supporta la struttura dello strato corneo, l’omeostasi della barriera e i processi legati alla desquamazione che influenzano l’idratazione e la resilienza meccanica della pelle. Alterazioni dell’espressione o della regolazione di FLG2 sono state associate a disfunzioni della barriera epidermica e a fenotipi cutanei infiammatori, tra cui la dermatite atopica e quadri simili all’ittiosi. Come indicatore dei programmi di differenziazione, FLG2 viene comunemente studiato insieme alle vie di cheratinizzazione, cornificazione e risposta allo stress nella biologia epiteliale.

Filaggrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FLG2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Filaggrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FLG2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FLG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Filaggrin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FLG2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Filaggrin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Filaggrin 2 nelle cellule tumorali con espressione di FLG2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.