Espin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403106-ACT

L’ESPN umano codifica espin, una proteina che raggruppa i filamenti di actina e regola l’assemblaggio e la stabilità di fasci paralleli di filamenti di actina nei microvilli e nelle stereociglia. Espin sostiene la morfogenesi di protrusioni specializzate, l’architettura meccanosensoriale e il rimodellamento del citoscheletro coordinando la dinamica dell’actina e le impalcature associate alla membrana. Grazie al suo impatto sull’organizzazione delle stereociglia, ESPN è collegato alla funzione delle cellule ciliate sensoriali ed è studiato nei percorsi che governano la specializzazione della superficie epiteliale e la meccanotrasduzione. La disregolazione o le alterazioni genetiche di ESPN sono state associate a deficit uditivi ereditari e a difetti correlati nella struttura delle stereociglia, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi di malattia del citoscheletro.

Espin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ESPN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Espin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ESPN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ESPN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Espin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ESPN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Espin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Espin nelle cellule tumorali con espressione di ESPN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.