ERK 5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400891-ACT

MAPK7 codifica ERK5, una MAP chinasi atipica che integra segnali provenienti da fattori di crescita, citochine e stress cellulare per regolare programmi trascrizionali che controllano proliferazione, differenziamento e sopravvivenza. ERK5 viene attivata a valle di MEK5 e modula bersagli che includono i fattori di trascrizione della famiglia MEF2, collegando la segnalazione MAPK alla funzione endoteliale, al rimodellamento del citoscheletro e alle risposte allo stress meccanico o ossidativo. Grazie alla sua attività chinasica e al peculiare dominio C-terminale di attivazione trascrizionale, ERK5 influenza la progressione del ciclo cellulare e l’espressione genica associata alla migrazione. Un’alterazione della segnalazione MAPK7/ERK5 è stata associata a cambiamenti nella segnalazione angiogenica e nel cablaggio di vie oncogeniche in molteplici contesti tumorali, rendendola rilevante per studi meccanicistici sul crosstalk tra reti MAPK.

ERK 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAPK7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERK 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAPK7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAPK7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERK 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAPK7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERK 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERK 5 nelle cellule tumorali con espressione di MAPK7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.