ER71 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420239-ACT

Il gene murino *Etv2* codifica il fattore di trascrizione della famiglia ETS ER71, un regolatore principale della specificazione emato-endoteliale durante le prime fasi dell’embriogenesi. ER71 integra gli input dei segnali di sviluppo per controllare programmi trascrizionali che guidano la morfogenesi vascolare, la differenziazione endoteliale e l’emergenza delle linee ematopoietiche, inclusa la regolazione di reti geniche endoteliali chiave. L’attività di *Etv2* interseca vie che governano angiogenesi e vasculogenesi, e la sua disregolazione viene utilizzata per modellare difetti dello sviluppo cardiovascolare e un’identità endoteliale aberrante in sistemi sperimentali. Poiché *Etv2* è espresso in modo transitorio ed è strettamente controllato in termini di dosaggio, è ampiamente studiato in paradigmi di riprogrammazione e in workflow di lineage tracing che analizzano le decisioni di destino dei progenitori endoteliali e del sangue.

ER71 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Etv2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ER71 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Etv2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Etv2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ER71. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Etv2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ER71 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ER71 nelle cellule tumorali con espressione di Etv2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.