EPAS-1/HIF-2 alpha Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400647-ACT

EPAS1 codifica EPAS-1/HIF-2α, un fattore di trascrizione sensibile all’ossigeno che si associa ad ARNT per coordinare i programmi di espressione genica durante l’ipossia. EPAS-1/HIF-2α regola vie che controllano l’angiogenesi, l’eritropoiesi, il metabolismo del ferro e l’adattamento glicolitico attraverso il controllo trascrizionale di bersagli responsivi all’ipossia. La sua attività è modulata dall’idrossilazione delle prolina e dalla degradazione proteasomiale dipendente da VHL, integrando la disponibilità di ossigeno con il metabolismo cellulare e le risposte allo stress. Una segnalazione di EPAS1 deregolata è implicata in un rimodellamento vascolare e metabolico anomalo ed è associata a fenotipi guidati dall’ipossia rilevanti per la biologia del cancro e per la ricerca sulle malattie cardiopolmonari.

EPAS-1/HIF-2 alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPAS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EPAS-1/HIF-2 alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPAS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPAS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EPAS-1/HIF-2 alpha. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPAS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EPAS-1/HIF-2 alpha nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EPAS-1/HIF-2 alpha nelle cellule tumorali con espressione di EPAS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.