EP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401146-ACT

PTGER4 codifica il recettore umano della prostaglandina E4 (EP4), un recettore accoppiato a proteine G che lega la PGE2 per stimolare l’adenilato ciclasi e aumentare i livelli di cAMP, attivando la segnalazione PKA/CREB e i programmi trascrizionali a valle. La segnalazione di EP4 interseca le vie PI3K–AKT ed ERK/MAPK per modulare, in modo dipendente dal contesto, la sopravvivenza cellulare, la migrazione, la permeabilità vascolare e la produzione di citochine. Questo recettore contribuisce alla regolazione delle risposte immunitarie innate e adattative e partecipa ai circuiti infiammatori attraverso un feedback mediato dalle prostaglandine. Un’attività disregolata di PTGER4/EP4 è stata associata a fenotipi immunitari e infiammatori ed è frequentemente studiata in modelli di interazioni tumore–sistema immunitario e di rimodellamento tissutale.

EP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTGER4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTGER4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTGER4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTGER4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EP4 nelle cellule tumorali con espressione di PTGER4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.