ECH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406076-ACT

ECH1 (enoil-CoA idratasi 1) è un enzima mitocondriale che catalizza una fase di idratazione nella β-ossidazione degli acidi grassi e partecipa al catabolismo di intermedi acil-CoA a catena ramificata e insaturi. Sostenendo l’utilizzo mitocondriale dei lipidi e la disponibilità di acetil-CoA, ECH1 contribuisce all’omeostasi energetica cellulare e si collega a programmi metabolici più ampi che intersecano l’equilibrio redox e la funzione mitocondriale. Alterazioni dell’ossidazione degli acidi grassi e il rimodellamento metabolico mitocondriale sono caratteristiche ricorrenti dei disturbi metabolici e della biologia dei tumori, rendendo ECH1 un nodo utile per studiare come il flusso lipidico influenzi la crescita cellulare, l’adattamento allo stress e la segnalazione metabolica. ECH1 è inoltre rilevante per indagare il crosstalk tra perossisomi e mitocondri e la gestione di intermedi degli acidi grassi potenzialmente tossici.

ECH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ECH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ECH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ECH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ECH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ECH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ECH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ECH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ECH1 nelle cellule tumorali con espressione di ECH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.