DNA-PK_CS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422405-ACT

Prkdc codifica la subunità catalitica della DNA-protein chinasi dipendente dal DNA, DNA-PKCS, un regolatore centrale della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA tramite giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ). DNA-PKCS forma un oloenzima attivo con il complesso Ku70/Ku80 per coordinare il riconoscimento delle estremità, la sinapsi, la processazione delle estremità e la ligazione, e interagisce con la segnalazione ATM/ATR modulando le risposte di checkpoint in seguito a stress genotossico. Nelle cellule murine, l’attività di Prkdc è inoltre essenziale per la ricombinazione V(D)J durante lo sviluppo dei linfociti, collegando questa chinasi alla stabilità del genoma e alla maturazione del sistema immunitario. L’alterazione delle vie di riparazione dipendenti da DNA-PKCS è ampiamente utilizzata per modellare la radiosensibilità, l’instabilità cromosomica e i difetti di riparazione del DNA rilevanti per la biologia dei tumori e la ricerca sulle immunodeficienze.

DNA-PKCS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Prkdc senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA-PKCS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Prkdc nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Prkdc, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA-PKCS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Prkdc nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA-PKCS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA-PKCS nelle cellule tumorali con espressione di Prkdc silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.