DEC2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429771-ACT

Bhlhe41 codifica DEC2, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix (bHLH) che si lega ai motivi E-box e modula le reti geniche circadiane e i circuiti di feedback trascrizionale. Nel topo, DEC2 partecipa alla regolazione della tempistica sonno–veglia, dell’eccitabilità neuronale e dell’omeostasi metabolica interagendo con i componenti principali dell’orologio biologico e controllando la trascrizione ritmica a valle. La proteina influenza anche programmi trascrizionali associati alla linea cellulare, collegando segnali ambientali alle transizioni di stato cellulare. Un’alterata attività di DEC2 è stata associata a fenotipi di durata del sonno e a una più ampia disregolazione di vie controllate dal ritmo circadiano, rilevanti per la neurobiologia e per il metabolismo sistemico.

DEC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Bhlhe41 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DEC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Bhlhe41 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Bhlhe41, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DEC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Bhlhe41 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DEC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DEC2 nelle cellule tumorali con espressione di Bhlhe41 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.