DCC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401035-ACT

DCC (deleted in colorectal carcinoma) codifica un recettore di netrina-1 e un recettore di dipendenza che coordina la guida assonale, la migrazione neuronale e il rimodellamento del citoscheletro attraverso segnali provenienti dalla matrice extracellulare. Oltre alla neurobiologia dello sviluppo, la segnalazione di DCC si interfaccia con vie che controllano l’adesione cellulare, la polarità e l’apoptosi, con effetti a valle sulla dinamica delle GTPasi Rho e su processi collegati a MAPK/PI3K. Alterazioni dell’espressione o della funzione di DCC sono state associate a una formazione compromessa dei circuiti neurali e alla biologia tumorale, in cui cambiamenti nella segnalazione netrina–DCC possono influenzare i segnali di sopravvivenza, l’invasione e comportamenti di tipo epitelio–mesenchimale. Queste caratteristiche rendono il DCC umano un bersaglio prezioso per studiare la trasduzione dei segnali di guida, le interazioni cellula–cellula e risposte apoptotiche dipendenti dal contesto.

DCC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DCC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DCC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DCC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DCC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DCC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DCC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DCC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DCC nelle cellule tumorali con espressione di DCC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.