D5DR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404047-ACT

DRD5 codifica il recettore umano della dopamina D5 (D5DR), un recettore accoppiato a proteine G che si associa principalmente a Gs/olf per stimolare l’adenilil ciclasi, aumentare i livelli di cAMP e attivare la segnalazione dipendente da PKA. Il D5DR modula l’eccitabilità neuronale e la plasticità sinaptica regolando i canali ionici e le reti di fosforilazione, e interagisce con MAPK/ERK e con altre vie di secondi messaggeri a valle della neurotrasmissione dopaminergica. L’espressione e la segnalazione di DRD5 vengono studiate nel contesto della funzione dei circuiti dopaminergici, dei fenotipi neurocomportamentali e del cross-talk recettoriale che modella le risposte alla segnalazione catecolaminergica. Una segnalazione dopaminergica deregolata, inclusa un’alterata attività del D5DR, è rilevante per la ricerca sui disturbi neuropsichiatrici e del neurosviluppo e sui meccanismi di desensibilizzazione e traffico dei recettori.

D5DR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DRD5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

D5DR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DRD5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DRD5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di D5DR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DRD5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da D5DR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via D5DR nelle cellule tumorali con espressione di DRD5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.