cyclin T1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400623-ACT

CCNT1 codifica la ciclina T1, il partner regolatorio di CDK9 nel complesso del fattore positivo di allungamento della trascrizione b (P-TEFb), che stimola il rilascio dalla pausa della RNA polimerasi II fosforilando la CTD e i fattori negativi di allungamento. Attraverso il controllo dell’allungamento trascrizionale, la ciclina T1 influenza la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA e i programmi di differenziamento, ed è un fattore dell’ospite centrale sfruttato da Tat di HIV-1 per potenziare la trascrizione virale. Alterazioni dell’attività di P-TEFb e della disponibilità di ciclina T1 sono state collegate a reti trascrizionali deregolate osservate nella biologia del cancro e in contesti di segnalazione infiammatoria. CCNT1 è quindi ampiamente studiato in vie che governano il controllo della trascrizione, la regolazione associata alla cromatina e l’espressione genica responsiva allo stress.

cyclin T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin T1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin T1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin T1 nelle cellule tumorali con espressione di CCNT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.