copine 8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426239-ACT

Il gene murino Cpne8 codifica copina 8, una proteina legante fosfolipidi in modo calcio-dipendente che contiene domini C2 e un dominio A che supporta un’associazione regolata alla membrana. I membri della famiglia delle copine sono implicati in eventi di segnalazione innescati dal calcio a livello della membrana plasmatica e dei compartimenti endomembranosi, influenzando il traffico vescicolare, il rimodellamento delle membrane e la dinamica di reclutamento delle proteine. Accoppiando i flussi di Ca2+ alle interazioni proteiche prossimali alla membrana, copina 8 è rilevante per vie che modellano il turnover dei recettori e l’ampiezza della segnalazione intracellulare. La regolazione alterata del calcio e delle reti di traffico di membrana è spesso studiata in contesti quali la comunicazione neuronale, la segnalazione immunitaria e le risposte allo stress, rendendo Cpne8 un bersaglio utile per l’interrogazione meccanicistica delle vie di segnalazione.

copine 8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cpne8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

copine 8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cpne8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cpne8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di copine 8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cpne8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da copine 8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via copine 8 nelle cellule tumorali con espressione di Cpne8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.