CLC-KA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404050-ACT

CLCNKA codifica il canale del cloruro CLC-KA, un membro della famiglia CLC arricchito nel rene che contribuisce alla conduttanza basolaterale di Cl⁻ negli epiteli del nefrone distale. Supportando il trasporto trans-epiteliale dei sali e l’accoppiamento elettrochimico con il trasporto di Na⁺, CLC-KA partecipa a vie che regolano l’equilibrio elettrolitico renale e l’omeostasi dei fluidi extracellulari. L’attività del canale è funzionalmente collegata a subunità accessorie come barttina (BSND) e si integra con i processi di trasporto nel tratto ascendente spesso dell’ansa di Henle e nel tubulo distale. Alterazioni genetiche o regolatorie di CLCNKA sono state associate a fenotipi con perdita di sale e a disturbi della gestione renale del cloruro, rendendolo rilevante per studi meccanicistici delle tubulopatie e della regolazione del trasporto ionico.

CLC-KA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLCNKA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CLC-KA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLCNKA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLCNKA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CLC-KA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLCNKA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CLC-KA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CLC-KA nelle cellule tumorali con espressione di CLCNKA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.